纯化攻略 | 凝胶过滤层析技术：从机制到应用的系统化指南
2025/05/12
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析，又称分子排阻层析或分子筛层析，是一种根据生物分子大小和形状进行分离的层析技术。广泛应用于生物大分子的纯化、分子量测定、脱盐及去除小分子杂质、病毒疫苗的纯化等领域。
凝胶过滤微观原理示意
Gel Chromatography
技术原理
利用多孔凝胶介质的分子筛作用，根据分子大小差异进行分离。凝胶介质内部具有不同大小的孔径，大分子物质无法进入凝胶颗粒内部，只能沿着颗粒间的空隙移动，因此较快通过层析柱；小分子物质则可以进入凝胶颗粒内部，路径较长，因此较慢通过层析柱。
01
优势特点
非常适合对pH变化、金属离子或辅助因子浓度以及大环境情况敏感的生物分子。
凝胶介质为惰性的球状疏松多孔颗粒，不带电荷，吸附力弱，对分离成分理化性质的保持效果好，具有均匀的分离范围；
可以根据实验需要在存在必需离子或辅助因子、去污剂、尿素、盐酸呱啶、高或低离子强度、37℃或寒冷的房间进行生物分子的分离；
纯化的蛋白可以在任何选定的缓冲液中进行收集，缓冲液成分不直接影响分辨率；
对装柱效果要求较高，一般推荐使用预装柱。
02
材质分类
按机械强度分
软质凝胶（葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶）；
半刚性凝胶（苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）；
刚性凝胶（高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、多孔球形硅胶、羟基化聚醚多孔微球）。
按化学性质分
有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；
无机凝胶（非均匀凝胶）。
03
典型层析步骤
纯化设备的选择
简单的缓冲液交换和除盐步骤可以使用注射器或者外周蠕动泵和预制的HiTrap柱子一起进行。如果进行高分辨率分离，就需要色谱系统（AKTA、HPLC等）来精确的控制流速。
凝胶过滤操作
1
平衡
Equilibration
使用相应的缓冲液冲洗层析柱，使层析柱平衡至所需的实验条件中。
2
上样
sample load
将合适体积的样品通过样品环等容器加入层析柱中。
3
洗脱
Elution
使用平衡缓冲液冲洗层析柱，使加入层析柱的样品逐渐被分开并洗脱到不同的组分中。
04
凝胶过滤选择指南
主要考虑到两个方面：样品的应用目的和填料的分离范围。根据样品应用目的的不同，我们可以将凝胶过滤填料分为如下三种：
1.适用于分析纯化的产品
用于分析的样品，量比较少，而且对于纯度有极高的要求。所以，用于分析纯化的层析柱一般不会太高 (15到30 cm)，上样体积在柱体积的0.3%到0.5%之间。体积小、高度小的层析柱可以在保证高分辨率的同时，减少运行时间，并节省样品和缓冲液的使用量。
2.适用于制备纯化的产品
制备样品与分析样品相比，量稍大一些，对于纯度的要求较高但不必达到分析纯度。所以，一般会选用较高的柱子 (60 cm以上)进行纯化，上样体积一般在柱体积的0.5%到4%。
3.适用于脱盐与缓冲液置换的产品
适用于脱盐与缓冲液置换的产品：脱盐与缓冲液的置换，本质上就是大分子样品与小分子 (离子)的缓冲液组分之间的分离。这种情况下，对于分辨率的要求相对不如前两种情况高，而且，由于分子量差异较大，上样体积可以达到柱体积的30%。
由于不同凝胶过滤填料的孔径不同，因此，每种填料都有特定的分离范围。为了保证纯度，推荐在组分分子量相差一倍以上时，才可以试用凝胶过滤的方法进行纯化。
Cytiva在凝胶过滤产品的开发上有着悠久的历史。到如今，已经有数十款填料与预装柱产品，用于不同场景的纯化工作。
Cytiva的凝胶过滤产品家族
· Sephadex
Sephadex系列填料诞生于1959年，是Cytiva最早的凝胶过滤填料产品系列。按照填料基架交联度的不同，产品名称用Sephadex G加数字来区别 (如G-10、G-15等)，数字越小交联度越大，形成的平均孔径越小，分离范围也会越小。目前，Sephadex填料主要用于脱盐与缓冲液的置换，是非常经典的一款凝胶过滤填料。
图 Sephadex G-25脱盐效果实验
· Sepharose
Sepharose是传统的偶联琼脂糖填料，非特异性吸附性低，回收率高。Sepharose具有非常宽阔的分离范围，适合分离分子量大小差异大并对分辨率要求不高的样本。
Sepharose CL系列填料由Sepharose和2,3-二溴丙醇反应而成，增强了Sepharose的物理和化学稳定性。特别适合含有机溶剂的分离，能承受较强的在位清洗，并可以高温消毒，同时在流速方面也比传统的Sepharose填料有了明显的提升。
Sepharose Fast Flow填料为高度交联的琼脂糖填料，大大加强了机械性能，流速特快，适合工业规模生产。该填料经去电荷处理，非特异性吸附特低，回收率也得到了了提高。极高的化学稳定性，可用多种促溶剂、有机溶剂工作及1-2M NaOH进行在位清洗。
· Sephacryl
Sephacryl具有多种不同分离范围的产品，提供了广阔的选择性。它不仅可以分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。而且，Sephacryl填料价格相对较低，经济高效，非常适合作为对实验成本有顾虑的客户的第一选择。
· Superose
Superose系列填料由高度交联琼脂糖构成，具有最宽广的分离范围，能够一次性分离生物大分子大小差异大的混合物。填料本身刚性好、颗粒细小并且大小分布集中，所以允许高流速的纯化工作，在中、高压层析系统当中均有良好的使用效果。
· Superdex
Superdex系列是目前Cytiva产品中分辨率和选择性最高的凝胶过滤填料，流速快且反压低。此外，Superdex的化学物理稳定性很高，可以在高粘性洗脱液 (如8 M尿素)和相对较高的流速下运行。在常用的水性缓冲液和添加剂 (如去污剂、变性剂)中化学稳定，并可以耐受1 M的NaOH清洗。
· Increase平台
Increase平台是Cytiva新一代的凝胶过滤预装柱产品，专门为小规模的制备纯化及分析设计。相比原有的高分辨率凝胶过滤产品，Increase平台提供：
更高的通量，节省实验时间；
更高的分辨率，提高蛋白纯度与分析数据的精度；
批次间差异更小，获得更好的可重复性。
Cytiva凝胶选择指南
Cytiva SEC Increase预装柱提供了丰富的选择与卓越的性能，为每一次蛋白纯化，样品分离都保证了不凡的表现。
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